電話：
021-67610176傳真：
隨著分子生物學和分子化學的飛速發(fā)展，對病原微生物的鑒定已不再局限于對它的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特性等一般檢驗上，而是從分子生物學水平上研究生物大分子，特別是核酸結(jié)構(gòu)及其組成部分。在此基礎上建立的眾多檢測技術中，核酸探針（Nuclear acid probe）以其敏感、特異、簡便、快速的特點成為世人矚目的生物技術革命的新產(chǎn)物，已逐步應用于病原微生物的檢測。
核酸探針是將已知核苷酸序列DNA pian段用同位素或其他方法標記，加入已變性的被檢DNA中 ，在一定條件下即可與該樣品中有同源序列的DNA區(qū)段形成雜交雙鏈，從而達到鑒定樣品中DNA的目的，這種能認識到特異性核苷酸序列有標記的單鏈DNA分子就稱為核酸探針或基因探針。根據(jù)核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分為DNA探針或RNA探針，一般大多選用DNA探針；根據(jù)選用基因的不同分為兩種，一種探針能同微生物中全部DNA分子中的一部分發(fā)生反應，它對某些菌屬、菌種、菌株有特異性，另一種探針只能限制性同微生物中某一基因組DNA發(fā)生雜交反應，如編碼致病性的基因組，它對某種微生物中的一種菌株或僅對微生物中某一菌屬有特異性。這類探針檢測的基因相當保守，包括大部分rRNA，因為他既可能在一種微生物中出現(xiàn)，又可代表一群微生物。如應用rRNA探針檢測作為篩選食品污染程度的指示菌E.Coli。選擇探針的原則是只能同檢測的細菌發(fā)生雜交反應，而不受非檢菌存在的干擾。
1 核酸探針的特點：
1.1探針的特異性
核酸探針檢測技術的zui大特點是特異性，就是說一個適當組建的DNA探針能特異性地與所檢微生物而不與其他微生物發(fā)生反應。對食品檢測而言，就是不與樣品中內(nèi)源性雜菌和樣品自身DNA發(fā)生非特異性反應。以往檢測方法檢測的是基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物）。檢測這種物質(zhì)受多種因素影響。比如食品中微生物因受應激損傷（高溫、冷凍、化學制劑等）會導致基因組的變化，從而引起其表達產(chǎn)物的變化。而核酸探針檢測的基因本身，它能識別基因本身的變異，不受基因表達產(chǎn)物的影響。常規(guī)免疫學方法檢測抗原、抗體，他們都是蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)由氨基酸組成，而氨基酸由核苷酸序列確定，一旦這種序列受外界影響發(fā)生變異，就會導致其產(chǎn)物的變化，影響抗原抗體間的反應，使檢測特異性下降。檢測病毒主要通過組織培養(yǎng)后，檢測病毒相關的蛋白質(zhì)囊膜，即使采用超低溫保存，有時也會引起編碼蛋白質(zhì)囊膜基因的變化，而采取DNA探針檢測病毒則不用改變其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而只需檢測是否有相應特異性的編碼蛋白質(zhì)囊膜的病毒靶DNA序列。另外，核酸之間的識別連接比抗原抗體準確，并且探針檢測比免疫學方法靈活。盡管看來形成抗原抗體復合物比核酸雜交快，但能通過加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍，從而提高反應速度，核酸比蛋白質(zhì)耐受高溫（100℃）、有機溶劑、螯合劑和高濃度工作液的破壞作用，所以用比提取蛋白質(zhì)強烈的多的方法制備核酸，不會影響雜交反應。當然RNA探針除外，因為RNA不耐受堿處理，需用其它方法制備檢測用RNA。核酸探針的特異性取決于探針的堿基序列和使用條件，如在不嚴格條件下（低溫高鹽）探針與靶DNA誤交結(jié)合力比嚴格條件下穩(wěn)定。探針長度也會影響反應的特異性，一般加Formamide增加反應特異性。
1.2 探針的敏感性
研制核酸探針是為了檢測出單個病毒和細菌。DNA探針敏感性取決于探針本身和標記系統(tǒng)。32P標記物通?？蓹z出10－8摩爾特異DNA pian段，相當于0.5pg，1000個堿基對的靶系列，相當于1000－10000個細菌。用親和素標記探針檢測1小時培養(yǎng)物DNA含量在110pg，兩者敏感性大致相同，而血清學方法只能達到1ng的水平。延長培養(yǎng)時間，增強信號強度能提高探針的敏感性。非放射性物標記探針在高濃度情況下，由于抑制了非特異性吸附，比放射性物標記探針背景干擾小。在探針上加生物素化的核苷酸長尾能使檢測敏感性提高10倍。細胞中rRNA比rDNA多，檢測rRNA比rDNA敏感。通過擴增DNA含量也能提高檢測敏感性。
2 核酸探針技術在食源性病原微生物檢測上的應用
2.1 沙門氏菌
食品中沙門氏菌污染量小，常受應激損傷，不易恢復，現(xiàn)用檢測方法得到陰性報告zui少需四天，陽性報告還要延遲2－3天。研究檢測沙門氏菌的探針難度大，因為它擁有2000多個血清型，還不清楚它們是否存在共同特異性的致病因子。Fillal等人從染色體序列和構(gòu)建的質(zhì)粒文庫中分離到一個適用于沙門氏菌檢測的探針。它能和沙門氏菌而不和其他微生物及樣品培養(yǎng)基發(fā)生非特異性反應。這種用同位素標記的探針，能識別350株不同的沙門氏菌。由于該方法zui小檢出量只有1個細菌/25克樣品，所以需要增菌培養(yǎng)。AOACzui近認可了Gene-Tark沙門氏菌比色分析法，這種探針標記物為異硫氰酸熒光素（FITC）,再用辣根過氧化物酶標記抗FITC的抗體結(jié)合放大探針，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶浸染棒固相薄膜上雜交，對239株沙門氏菌的特異性檢出率為100%，假陽性率為0.8%(BAM/AOAC培養(yǎng)法假陽性率為2.2%)。
2.2 大腸桿菌
大腸桿菌是食品和水源污染糞便的指示菌。Tark研制出用浸染棒檢測大腸桿菌中16srRNA的探針。樣品需要前增菌處理，以異硫氰熒光素（FITC）標記探針，再用辣根過氧化物酶標記抗FITC抗體檢測雜交復合物。Hsu等報道其特異性達100%，假陽性率為1.2%（目前使用的BNM/AOAC法為23.4%）。Sander等構(gòu)建了一個能檢測產(chǎn)生與志賀氏菌毒素相同毒素的大腸桿菌菌株（SLTEC）的探針。增菌后能檢測牛肉和其它食品中是否存在有SLTEC。1990年Feng.p等研制出大腸桿菌GUD（β－葡萄糖醛酸酶 ）基因的探針，GUD是AOAC認可的MUG（4－甲基傘形酮β－葡萄糖醛酸）試驗中檢測的酶，現(xiàn)用PCR法擴增GUD基因，再用DNA探針雜交。MUG試驗既MUG在GUD作用下釋放出4－甲基7－羥香豆素，它在長波紫外光照射下產(chǎn)生藍色熒光。
2.3 李斯特桿菌
1981年確定它是一種食源性病原菌，1985年加利福尼亞發(fā)生爆發(fā)性流行，現(xiàn)用檢測方法大多采用冷增菌，費時費力。FDA于1987年研制出針對李斯特菌致病基因β－溶血素的探針，隨后GENE-TARK研制出商品化檢測李斯特菌的DNA探針，它能特異性識別細菌的16SrRNA。該探針是由人工合成的寡核苷酸，用比色法檢測樣品；需先在LEB中培養(yǎng)16－22h,然后浸染比色檢測。
2.4 弧菌 國外對DNA探針和單克隆抗體法在檢測鞭毛方面作了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA探針法陽性檢出率高。近年來用PCR擴增DNA pian段，再做探針檢測，能檢出新鮮龍蝦仁中的弧菌，檢測靈敏度為10個細菌/克，但要用凝膠電泳進一步鑒定。因此不太適合檢測食品。1989年Olive構(gòu)建了一個熱穩(wěn)定溶血素基因的寡核苷酸DNA探針檢測副溶血弧菌。
2.5 彎曲桿菌
檢測彎曲桿菌的探針是用非放射性物質(zhì)標記的。標記物為發(fā)光素，靶序列為rRNA。近年來用堿性磷酸酶標記人工合成的寡核苷酸檢測人工污染的糞便樣品，檢測量為100000個菌落形成單位（CPU），敏感性和特異性達100%。
2.6 葡萄球菌 大多數(shù)檢測葡萄球菌的探針是針對腸毒素的，它們能同編碼腸毒素有關的基因序列雜交，這類探針能檢測腸毒素A、B、C和E。zui近，Gene Tark推出檢測金黃色葡萄球菌的探針，方法采用浸染棒比色法，探針檢測的基因序列是23SrRNA。敏感性100%，假陽性率為9.3%。
13916499749
